作者：谷禾健康
益生菌可以產生有益的維生素、消化酶、必需氨基酸、免疫調節和抗菌代謝產物，從而促進人體健康，預防腸道炎症性疾病、自身免疫性疾病和胃腸道感染。
其寶貴特性已得到健康行業、醫療專業人士和公眾的認可。
比起單菌株益生菌，多菌株益生菌在改善腸道微生物群穩定性和宿主健康更具優勢。
然而，總的來說，尚不清楚不同菌株會在多大程度上合作或競爭資源，以及共同生物膜微環境的建立如何影響它們的相互作用。
需要新的方法來設計合成益生菌聯合體，以克服單一菌株配方的局限性。
羅伊氏乳桿菌Lactobacillus reuteri 和 佈拉酵母菌Saccharomyces boulardii是兩種重要的益生菌。
羅伊氏乳桿菌L. reuteri是一種革蘭氏陽性桿菌，可以抑制病原微生物的定植並改善宿主共生微生物群組成的平衡，減少促炎細胞因子的產生，可以加強腸道屏障功能。
關於羅伊氏乳桿菌詳見：認識羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)
佈拉酵母菌S. boulardii是一種對胃環境有抵抗力並在低 pH 條件下具有良好生存能力的酵母。
它帶來腸道屏障功能的改善、病原體競爭排斥、抗菌肽的產生、免疫調節和營養效應。
本文介紹和驗證了一個系統的方法來描述微生物在多種生長條件下的相互作用，該方法將共培養分析與代謝的基因組規模建模和多變量數據分析相結合，並將其應用於L. reuteri 和 S. boulardii這兩種益生菌之間的相互作用，表征它們產生有益於人類健康的化合物的潛力。
結果表明，這些菌株可以建立一種混合的合作-拮抗相互作用，最好的解釋是爭奪共享資源，個體交換增加，但氨基酸和短鏈脂肪酸的凈產量通常減少。
方法
整個試驗方法主要分為三個部分：
微生物培養與生化測定實驗
基因組尺度代謝模型重建
對得到的數據進行多元統計分析
Part.1微生物培養與生化測定實驗
使用的菌株分別是：
Lactobacillus reuteri DSM20016 (DSMZ，德國)
Saccharomyces boulardii (Swiss Bioenergetics，瑞士)
同時準備兩種不同的培養基用於微生物培養，分別為tryptone soya broth(TSB)培養基和含0.4%葡萄糖的M9最小培養基。
為了測試菌株在不同生長條件下對生態相互作用(單一培養或混合培養)的影響，同時制作了含有10ml(浮遊培養物)或2ml(生物膜培養物)的培養液。
根據光密度、CFU數量和一組相關代謝物的濃度，對每個培養物進行長期監測。
生化測定使用生化檢測試劑盒分別測定培養基中的代謝物，葡萄糖、甘油、琥珀酸鹽、乙酸鹽、乙醇、短鏈脂肪酸、L-氨基酸和氨水平。
Part.2基因組規模模型重建
將觀察到的代謝活動擴展到基因組規模，對兩例菌株及微生物群和生物膜發展采用了專用的建模策略。
代表混合培養的微生物群落基因組尺度代謝模型《簡稱，GSMM模型》是通過 COBRA 工具箱中的 createMultipleSpeciesModel 函數創建的。
結果是創建了一個共同的細胞外隔間，其中單個GSMMs被封裝，並與環境共享邊界代謝物交換，有效的模擬了交叉喂養和營養競爭。
而為了模擬再現實驗觀察到的菌株在不同生長模式下的代謝活動，引入了群落生物量偽反應，定義如下:
μ LR和μ SB表示通過L. reuteri和S. boulardii的單個生物質假反應的通量。
文章中為L. reuteri菌株自動化構建了一個新GSMM模型。
新生成的模型包含了精選模型中54%的反應和69%的代謝物，幾乎將反應數量增加了一倍，引入的43%的代謝物隻有2.4%的通量不一致反應。
對於S. boulardii菌株，使用的是現有的iMM904模型，這是一個經過驗證的釀酒酵母GSMM模型。
為了全面了解每種條件下的代謝潛能，使用通量采樣充分探索可實現的代謝狀態。
Part.3多元統計分析
使用Matlab R2017b和R3.5軟件對數據進行了統計分析，主要有PCA、PLSCA和聚類分析。
結果
1. L.reuteri和S. boulardii的生態相互作用
觀察在單一培養和混合培養下分別以浮遊模式和生物膜模式生長時的幹重動態，如下圖：
結果表示：
S. boulardi菌株在6h時浮遊模式生長得更快更好
L. reuteri菌株在48h時形成了更好的生物膜
當菌種一起生長時，兩個菌株最終時間點的CFU濃度發生了顯著變化，如下圖：
結果表示：
L. reuteri 的浮遊生長模式在混合培養中急劇下降
S. boulardi 的浮遊生長則受到了積極的影響
分析兩種菌株生長模式的潛在機制
結果表示：
S. boulardi 是共生長的受益者
L. reuteri受到抑制
例如：S. boulardi 可能受益於L. reuteri 菌株產生的糖，同時 L. reuteri 可能會受到 S. boulardi菌株生長代謝的傷害。
例如：S. boulardi 生長耦合離子交換或有機酸的產生可能引發環境pH值降低，這可能在多個功能水平上影響 L. reuteri 的代謝。
在代謝水平上也觀察到單一培養和混合培養之間存在的一些差異，如下圖：
例如，M9混合培養6h的氨消耗量是相應的單一培養的近7倍。
還有，在浮遊和生物膜混合培養中，乙酸和琥珀酸的形成大約多兩倍。
統計值如圖D所示。
2.評估多菌株群落的基因組代謝潛力
上述生化數據表明，在乳酸菌-酵母組合中，乙酸鹽和琥珀酸鹽的產量增加，但試劑盒所能測的代謝物畢竟有限。
為了全面估計未直接測量的代謝潛能，采用了如方法所述的基因組建模。
圖A 分別為使用實驗測量數據和基於計算機建模預測生成的數據的PCA分析結果， 與實驗測量結果表現一致，隻是在建模產生的數據中更加放大了復雜培養基中的共培養物與各自的單一培養物之間的鴻溝。
研究人員因此有理由假設，在廣泛的水平上，這種模式也發生在體外。
圖B 觀察到不同條件導致的各代謝物的產出和消耗變化，如模型預測了S. boulardi的生物素分泌，當使用最小培養基時，生物素分泌在生物膜模式下減少，而在復雜培養基中增加。
類似地，多菌株環境與最小培養基中生物素產量的減少有關，而在復雜培養基中觀察到相反的趨勢。
為了評估模型預測的可信度，同時再現上述結果，研究人員測量了不同條件下的總氨基酸分泌率，如下圖顯示：
盡管模型通量相對於實驗值些許膨脹，但趨勢是一致的，特別是與 S. boulardi 菌株相比，混合培養中總氨基酸產量的下降。
因此，在所有條件下，S. boulardi 產生氨基酸的速率最高，但生物膜也與這種速率的大幅降低有關。
3.推斷菌株對不同生長條件的特異性反應
圖A應用PLSCA分析，重點研究了菌株水平的代謝交換率與包括菌株、培養基、培養類型和生長方式在內的因素集之間的關系。
可以觀察到菌株和培養基類型是對生長歸一化代謝物交換影響最大的參數，因為它們位於距離原點最遠的地方。
隨著作用強度的降低，培養類型(單一培養或共培養)和生長方式(生物膜、浮遊)也隨之改變。
其中，培養類型的影響比生長模式更強，這突出表明兩個物種之間的生態相互作用對它們的代謝物產生有顯著影響。
圖B展示了與實驗因素相關的交換機制，以及與之高度相關的代謝物。
下圖展示了在單一培養和共培養下，各代謝物歸一化後的增長率差異，以更好地評估群落建立的影響，並做出更詳細的互動機制假設。
可以看到，當在增長率歸一化時，許多健康相關化合物與單一培養相比，在共培養中產生得更多。
盡管總氨基酸產量下降，但當微生物在一起生長時，這些氨基酸實際上可能會進行大量的交換。
結論
這是一個綜合實驗和計算機建模方法來探究生長方式《生物膜vs浮遊生長》對生態相互作用《單一培養vs混合培養》的影響的研究。
研究發現，特定微生物代謝物的產生會受到生長模式、生長培養基的組成、微生物種類及其在共培養中的相互作用的顯著影響。
研究人員表示通過文中提出的計算方法，可以設計新的益生菌產品，並為代謝工程方法的應用提供科學見解，以優化所需有益代謝物的生產。
這可以提高某些益生菌產品的生物學和商業價值，直接造福於益生菌行業，臨床上也有可能為與腸道菌群相關的疾病制定更好的治療方案，如炎症性腸病、肥胖、2型糖尿病、心血管疾病、自身免疫和神經系統疾病。
參考文獻：
Zampieri G，Efthimiou G，Angione C. Multi-dimensional experimental and computational exploration of metabolism pinpoints complex probiotic interactions. Metab Eng. 2023 Jan 28;76:120-132. doi: 10.1016/j.ymben.2023.01.008. Epub ahead of print. PMID: 36720400.
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